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      English

      GB4789-6-2016 致瀉大腸埃希氏菌檢驗及注意事項

      發布時間:2021-11-26      瀏覽次數:3307    分享:

      致瀉大腸埃希氏菌生物學特性


      致瀉大腸埃希氏菌:一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希氏菌,可經過污染食物引起人類發病。
      大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性短小桿菌,分類學上屬于腸桿菌科大腸埃希氏菌屬。
      常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌EPEC、腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC、產腸毒素大腸埃希氏菌ETEC、產志賀毒素大腸埃希氏菌STEC(包括腸道出血性大腸埃希氏菌EHEC)和腸道集聚性大腸埃希氏菌EAEC。

      致瀉大腸埃希氏菌檢驗程序


      操作注意事項
            1:對易產生較大顆粒的樣品(如肉類)進行檢測時,建議使用帶濾網均質袋,以便均質后用吸管吸取勻液;
            2:取前增菌液接種腸道菌增菌肉湯后需在42±1 ℃溫度下進行培養,該溫度范圍內培養有助于抑制非腸道菌生長;
            3:分離劃線用直徑3mm的接種環(1環約10微升);
            4:可疑菌落的選取,應是每個瓊脂平板上分別取10~20個(10個以下的全選)乳糖發酵和不發酵的菌落;
            5:在TSI培養時,應將試管口松開,保持管內有充足的氧氣,否則由于氧氣不足,斜面酸性產物不能氧化恢復紅色。
            6:大腸埃希氏菌H抗原在傳代中容易丟失或發育不良,需在半固體上傳代3次,觀察生長,如不擴散,則表示H抗原丟失,無法做H抗原凝集試驗。

      培養基原理解析


      營養肉湯:
      胨和牛肉浸出粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源,氯化鈉能維持均衡的滲透壓,有利于損傷細菌的復蘇。

      腸道菌增菌肉湯:
      蛋白胨提供蛋白質、維生素和氨基酸;葡萄糖提供碳源;酸氫二鈉和磷酸二氫鉀為緩沖劑;牛膽鹽和煌綠為選擇性抑菌劑,抑制非腸桿菌科細菌的生長。

      麥康凱瓊脂(MAC):
      該培養基中含有牛膽鹽和結晶紫,可抑制革蘭氏陽性菌的生長,細菌發酵乳糖產酸時菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現膽鹽沉淀的渾濁圈。
      分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色,培養基周圍有膽鹽沉淀環;不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色。

      伊紅美藍瓊脂(EMB):
      乳糖作為可發酵碳源,伊紅和美藍同時作為抑菌劑和指示劑,在酸性條件下,兩者結合形成黑色沉淀并可產生金屬光澤。黑色程度與光澤產生情況與伊紅和美藍比例相關。
      分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤;不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色。

      三糖鐵瓊脂:
      該培養基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1,只能利用葡萄糖的細菌,葡萄糖被分解產酸使斜面先變黃,但因量少,生產的少量酸。因接觸空氣而氧化,加之細菌生長利用培養基中含氮物質,生成堿性產物,故斜面后來又變紅。底部由于厭氧狀態,酸類不被氧化,仍保持黃色。而發酵乳糖的細菌,則產生大量的酸,使整個培養基呈黃色。另外,因某些細菌能分解含硫氨基酸,生成硫化氫,硫化氫和培養基中的鐵鹽反應生成黑色的硫化亞鐵沉淀。

      氰化鉀利用試驗
      氰化鉀是細菌呼吸酶系統的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細菌的生長,但有的細菌在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長,以此鑒別細菌。
      結果判讀:陽性為試驗管和對照管都有生長變渾濁; 陰性為試驗管澄清不見生長,對照管生長渾濁。

      靛基質試驗
      某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。
      結果判讀:陽性為滴加靛基質試劑后液面立即變玫紅色;  陰性為滴加試劑后不變紅色。

      尿素酶試驗
      具有尿素酶的細菌分解培養基中的尿素,產生大量的氨,使培養呈堿性,酚紅指示劑在pH6.8時呈黃色,pH8.1呈粉紅色。
      結果判讀:陽性為玫紅色;  陰性為淡橙紅色-淡黃色。

      生化試驗結果判讀 - 大腸埃希氏菌的生化特征


      生化項目結果
      三糖鐵斜面產酸或不產酸,底層產酸,不產硫化氫
      尿素(pH7.2)陰性
      靛基質試驗陰性
      KCN陰性

      取生化反應符合大腸埃希氏菌特征的菌落進行PCR確認試驗

      PCR確認試驗 - 致泄大腸埃希氏菌特征基因


      PCR試劑盒檢測流程


      致瀉大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒特點


      致瀉大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒,各試劑盒檢測的對應特征性基因如下:

      試劑盒貨號檢測菌株類別檢測基因組合
      KJD02P

      EPEC

      STEC

      EHEC

      uidA
      bfpB
      escV
      stx2
      stx1
      KJD03PEAECuidA
      pic
      aggR
      astA
      KJD04PETECuidA
      sth
      lt
      stp
      KJD05PEIECuidA
      invE

      形態組分名稱規格×數量
      凍干型干粉試劑18管×3排
      干粉試劑2(EIEC除外)8管×3排
      液態復溶液1mL×1管
      凍干型陽性對照1管
      陰性對照

      1管ATCC25922

      DNA

      液態裂解液1 mL×1管
      裂解液1 mL×1管
      loading buffer240 μL×1管
      說明書1份

      血清學試驗(選做項目)


      取PCR試驗確認為致瀉大腸埃希氏菌的菌株進行血清學試驗。

      O抗原鑒定
      1)檢查培養物有無自凝性:在潔凈玻片上滴一滴生理鹽水,用接種環蘸少許待測培養物,混合于生理鹽水內,1分鐘內無凝集現象,為無自凝,反之,有自凝性。
      2)假定性試驗:先用大腸埃希氏菌O多價血清做玻片凝集,如果多價有凝集現象,再用多價所包含的單價O血清做試驗,如與某一單價O血清有凝集反應,即為假定性試驗陽性,反之為陰性。
      3)確證試驗:測試培養物制成3號麥氏濁度菌懸液,與假定陽性的O單價血清(原效價1:160~1:320,0.5%鹽水稀釋至1:40)等量混合,放50±1 ℃,培養16h,觀察結果,如凝集,可證實為該O抗原。

      H抗原鑒定
      先穿刺半固體,有動力再做H抗原鑒定。

      質量控制及疑難解析


      質量控制
            1: 為了控制環境污染,每次檢驗過程中,于檢驗臺上打開兩塊計數瓊脂平板,并在檢驗環境中暴露不少于15分鐘,將此平板與本批次樣品同時進行培養,以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環境的污染。
             2: 定期使用致瀉大腸埃希氏菌標準菌株或相應定量活菌參考品,在P2實驗室或陽性對照實驗室內,用適當的食品樣品進行陽性實驗驗證,染菌量應控制在10~100CFU/25g,并進行記錄,次驗證實驗至少每2個月進行1次。
             3:可以使用全自動或半自動的核酸提取儀提取DNA,但必須經過驗證后使用。
             4:每次PCR應使用EPEC EIEC ETEC STEC/EHEC EAEC標準菌作為陽性對照。同時使用大腸埃希氏菌ATCC25922或等效標準菌株作為陰性對照,以滅菌去離子水作為空白對照,控制PCR污染體系。

      疑難解析

      Q1:僅用毒力基因檢測就能對致瀉大腸埃希氏菌進行確認嗎?
            按照GB4789.6-2016要求,需要先對可疑菌落進行生化鑒定,生化鑒定為大腸埃希氏菌后,再進行毒力基因的檢測,判定是何種致瀉大腸埃希氏菌。因為在腸桿菌科中,一些致病也存在相同的毒力基因,所以不能對可疑菌落直接進行毒力基因檢測來判定何種致瀉大腸埃希氏菌。

      Q2:如何看待血清型與PCR結果不符的情況?
            確實有這情況存在,由于血清型判定依據是菌體抗原(O抗原、H抗原、K抗原),這些抗原并不是致瀉大腸埃希氏菌發病的根本原因,而且相同血清型致瀉大腸埃希氏菌中,存在不同致病型的大腸埃希氏菌,也就是說不同致瀉大腸埃希氏菌“共享”同一個血清型,這是血清鑒定致瀉大腸埃希氏菌的不足之處,另外,隨著人類對致瀉大腸埃希氏菌致病機制的認識,并找到引起不同致病型的特征性毒力基因,因此,現行標準以PCR為確認方法,而血清學診斷只是選做項目。

      所需培養基試劑


      用途貨號名稱規格
      樣品制備022010營養肉湯250g/瓶(干粉)
      22010D1營養肉湯225ml/袋
      增菌022160腸道菌增菌肉湯250g/瓶(干粉)
      分離022140麥康凱瓊脂培養基250g/瓶(干粉)
      024076麥康凱瓊脂培養基90 mm×20塊/盒
      022060伊紅美藍瓊脂培養基250g/瓶(干粉)
      024087伊紅美藍瓊脂培養基90 mm×20塊/盒
      生化實驗CP0080三糖鐵斜面20支/盒
      075240蛋白胨水20支/盒
      029030靛基質試劑10ml/支
      075150尿素20支/盒
      075330氰化鉀生長試驗管20支/盒
      075340氰化鉀對照管20支/盒
      HKI005EasyID致瀉大腸埃希氏菌生化鑒定試劑盒10test/盒
      071760致瀉大腸埃希氏菌生化鑒定盒8種×10次/盒
      PCR確認KJD02PEPEC-STEC-EHEC多重PCR檢測試劑盒24測試/盒
      KJD03PEAEC多重PCR檢測試劑盒24測試/盒
      KJD04PETEC多重PCR檢測試劑盒24測試/盒
      KJD05PEIEC多重PCR檢測試劑盒24測試/盒

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